亮點(diǎn)或者創(chuàng)新之處

本文將CRISPR-Cas12a系統(tǒng)與MRS傳感相結(jié)合，構(gòu)建基于CRISPR-Cas12a系統(tǒng)的MRS生物傳感器檢測(cè)沙門氏菌。充分利用MNPs作為磁分離工具和信號(hào)標(biāo)簽的雙重功能，為生物傳感器的設(shè)計(jì)提供了新思路。同時(shí)，得益于CRISPR-Cas12a系統(tǒng)的高特異性和MRS檢測(cè)的高靈敏度，該生物傳感器對(duì)沙門氏菌具有良好的檢測(cè)性能。

核心結(jié)論

構(gòu)建基于CRISPR-Cas12a的MRS生物傳感器檢測(cè)沙門氏菌。引入小粒徑的MNPs作為磁信號(hào)探針，開發(fā)MNPs產(chǎn)生信號(hào)的新功能。該生物傳感器通過CRISPR-Cas12a系統(tǒng)在目標(biāo)物存在下對(duì)biotin-S₁的切割作用控制兩種不同粒徑MNPs的結(jié)合，然后利用大小粒徑MNPs磁分離速度的差異，以溶液中游離的小粒徑MNPs為信號(hào)輸出分子檢測(cè)沙門氏菌。得益于CRISPR-Cas12a系統(tǒng)的高特異性和高效切割活性以及MRS檢測(cè)方法的高靈敏度，該生物傳感器對(duì)純菌液和雞肉提取液加標(biāo)樣品中沙門氏菌的LOD分別為1.3×10² CFU mL^-1和1.8×10³ CFU mL^-1，且可避免重復(fù)磁分離與洗滌，操作更為簡(jiǎn)便。

研究背景

MNPs可作為MRS傳感檢測(cè)中的磁性探針。傳統(tǒng)的基于MNPs聚集/分散狀態(tài)改變的MRS生物傳感方法易受樣品基質(zhì)干擾，穩(wěn)定性較差。基于MNPs數(shù)量變化的MRS生物傳感器已經(jīng)得到了較好的發(fā)展。但是以上方法需要目標(biāo)物自身提供位點(diǎn)以控制大小粒徑MNPs之間的結(jié)合。目標(biāo)物的表面位點(diǎn)有限且可能發(fā)生非特異性結(jié)合，因而檢測(cè)靈敏度會(huì)受到影響。為此，本文將CRISPR-Cas12a系統(tǒng)與MRS傳感技術(shù)相結(jié)合，利用CRISPR-Cas12a系統(tǒng)精準(zhǔn)控制兩種不同粒徑MNPs之間的結(jié)合，開發(fā)基于CRISPR-Cas12a的MRS生物傳感器檢測(cè)沙門氏菌。

實(shí)驗(yàn)方案或者實(shí)驗(yàn)材料

如圖1所示，分別在粒徑為130 nm和30 nm左右的MNP130和MNP30表面修飾SA和S2，制得SA修飾的MNP130（MNP130-SA）和S2修飾的MNP30（MNP30-S2）探針。當(dāng)目標(biāo)物存在時(shí)，Cas12a、crRNA和靶標(biāo)DNA形成三元復(fù)合體，并激活trans切割活性以非特異性切割biotin-S1。因此，MNP30-S2無法通過S1和S2之間的堿基互補(bǔ)配對(duì)作用結(jié)合至MNP130-SA表面，在磁場(chǎng)作用下仍分散在溶液中。反之，大量MNP30-S2結(jié)合至MNP130-SA表面，并在磁場(chǎng)作用下被分離。最后，以清液中游離的MNP30-S2為探針，通過橫向弛豫時(shí)間T2的測(cè)定檢測(cè)沙門氏菌。

圖1

紐邁核磁助力：利用低場(chǎng)核磁設(shè)備（PQ001，紐邁電子科技有限公司，上海，中國(guó)）測(cè)量獲得樣品的橫向弛豫時(shí)間T₂。在測(cè)定T₂時(shí)，儀器的溫度精確設(shè)置為32±0.01°C。利用硬脈沖序列Q-FID校準(zhǔn)儀器中心頻率O1及尋找90^o射頻脈寬P1和180^o脈寬P2。然后，利用Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）脈沖序列進(jìn)行T₂的測(cè)量。

結(jié)果分析

1：利用TEM表征MNP₁₃₀-SA在有無目標(biāo)物存在下的表面狀態(tài)。如圖2A所示，MNP₁₃₀-SA的粒徑為130 nm左右；而MNP₃₀-S₂的粒徑在30 nm左右。在無目標(biāo)物存在下，MNP₁₃₀-SA捕獲biotin-S₁，并與MNP₃₀-S₂結(jié)合，因此MNP₁₃₀-SA表面結(jié)合了大量MNP₃₀-S₂。而當(dāng)目標(biāo)物存在下，Cas12a/crRNA復(fù)合體的trans切割活性被激活，使biotin-S₁被非特異性切割，從而影響MNP₁₃₀-SA與MNP₃₀-S₂之間的結(jié)合。因此MNP₁₃₀-SA周圍僅有極少量MNP₃₀-S₂的存在。以上TEM表征結(jié)果證明了該生物傳感器檢測(cè)S. Typhimurium具備可行性。

圖 2

2：考察切割方式對(duì)檢測(cè)效果的影響。即方案1：先將biotin-S₁偶聯(lián)至MNP₁₃₀-SA表面制得MNP₁₃₀-S₁，然后利用CRISPR-Cas12a系統(tǒng)切割MNP₁₃₀表面的S₁；方案2：切割溶液中游離的biotin-S₁，然后加入MNP₁₃₀-SA進(jìn)行捕獲。采用方案1時(shí)，利用肉眼觀察分散性變化即可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的定性檢測(cè)，簡(jiǎn)單方便，但是靈敏度較低；而采取方案2則可顯著提高M(jìn)RS生物傳感器對(duì)目標(biāo)物的響應(yīng)。為提高檢測(cè)靈敏度，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)采取方案2的切割方式檢測(cè)沙門氏菌。

圖 3

3：從圖4可以看出，1.3×10² CFU mL^-1細(xì)菌濃度下的T₂值已低于閾值線，說明該方法可對(duì)1.3×10² CFU mL^-1的S. Typhimurium進(jìn)行檢測(cè)，其LOD明顯低于大部分已報(bào)道的MRS生物傳感器。對(duì)雞肉提取液加標(biāo)樣品中的S. Typhimurium進(jìn)行檢測(cè)。該方法對(duì)雞肉提取液中S. Typhimurium的LOD為1.8×10³ CFU mL^-1。將純菌液和雞肉提取液中的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，雞肉提取液中10³ CFU mL^-1細(xì)菌引起的信號(hào)響應(yīng)明顯高于純菌液（ΔT₂%分別為10%和47%）。為評(píng)估該生物傳感器對(duì)沙門氏菌的特異性，選取S. aureus、E. coli O157:H7、V. parahaemolyticus和L. monocytogenes四種常見食源性致病菌作為考察對(duì)象。S. Typhimurium和四種非目標(biāo)菌的濃度均為10⁵ CFU mL^-1。如圖所示，相較于空白對(duì)照，非目標(biāo)菌引起的信號(hào)變化率均在5%以內(nèi)，而目標(biāo)物S. Typhimurium則可引起60%以上的信號(hào)下降，體現(xiàn)了該生物傳感器良好的特異性。

圖 4

結(jié)論

本文提出了一種基于CRISPR-Cas12a系統(tǒng)的MRS生物傳感器檢測(cè)沙門氏菌。該方法利用CRISPR-Cas12a系統(tǒng)控制兩種不同粒徑MNPs的結(jié)合，并以游離的小粒徑MNPs為磁性探針實(shí)現(xiàn)MRS信號(hào)輸出，對(duì)純菌液和雞肉提取液加標(biāo)樣品中S. Typhimurium的LOD分別為1.3×10² CFU mL^-1和1.8×10³ CFU mL^-1。該方法充分利用了MNPs作為磁分離載體和信號(hào)標(biāo)簽的雙重功能。此外，檢測(cè)磁分離后的清液省去了繁瑣的重復(fù)洗滌操作，簡(jiǎn)化了檢測(cè)步驟。通過設(shè)計(jì)特定的crRNA，該方法亦可拓展至其他目標(biāo)物的檢測(cè)，具備一定的通用性。

該研究工作得到了國(guó)家自然科學(xué)青年基金，沃爾瑪基金會(huì)和沃爾瑪食品安全協(xié)作中心的的資助與支持。